L’alcolismo è considerato una piaga sociale per gli alti costi sanitari associati al recupero dei bevitori cronici, i quali hanno una ridotta produttività in ambito lavorativo e possono rappresentare un pericolo per la società, se soggetti a lavori di importanza comunitaria (guidatori di treni, pullman, taxi, aerei, natanti, ecc).
Nel corso degli ultimi decenni, il parametro di laboratorio che ha acquisito maggiore rilevanza, diventando un importante biomarcatore di abuso di alcool, con applicazioni cliniche e medico-legali, è sicuramente il test per la misura delle forme di Transferrina a basso grado di sialilazione, cumulativamente chiamate CDT (Carbohydrate Deficient Transferrin, o Transferrina Desialata).
Infatti, il consumo giornaliero di 50-80 g di alcol etilico (corrispondenti ad una bottiglia di vino con gradazione di 11-13°) causa già dopo una settimana un incremento oltre i valori di riferimento del valore di CDT nel siero. In caso di astinenza da alcol, il tempo di dimezzamento della CDT è di circa 15 gg, con una normalizzazione intorno alle 4 settimane.
Biochimica
La Transferrina è una glicoproteina di trasporto del ferro sintetizzata principalmente nel fegato ed è formata da una sola catena polipeptidica di 679 aminoacidi e due catene glucidiche, ciascuna terminante con delle ramificazioni che contengono acido sialico alle loro estremità.
Le catene glucidiche possono avere ramificazioni di acido sialico bi-, tri-, o tetra-antennate, le quali determinano una serie di glicoforme che prendono il nome dal numero dei residui terminali di acido sialico.
La glicoforma di Transferrina tetrasialo– (contenente 4 residui di acido sialico) è l’isoforma prevalente (74%-86%), seguita dalle isoforme pentasialo– (9,5%-19,4%), trisialo– (1,8%-10%), disialo– (0,5%-1,9%) ed esasialo– (0,1-2,7%).
Fig.1. Rappresentazione delle diverse forme di transferrina
Da: L.Bottaro, ASL3 Genovese, Regione Liguria. In: G.Testino et al, Caleidoscopio 233_Luglio 2015
In caso di abuso alcolico rimangono quasi inalterati i livelli delle isoforme di Transferrina ad elevato grado di sialilazione (triasialo-, tetrasialo-, pentasialo-, esasialo-); viceversa, aumentano nel siero le isoforme di Transferrina desialate (asialo-, monosialo-, disialo-), cumulativamente chiamate CDT.
Fig.2. Trasformazione delle isoforme dopo assunzione prolungata di etanolo
Da: L.Bottaro, ASL3 Genovese, Regione Liguria. In: G.Testino et al, Caleidoscopio 233_Luglio 2015
Limitazioni
Esistono varianti genetiche che interferiscono sul valore della isoforma disialo-. Tra le varianti con una prevalenza >1%, la più diffusa è la variante C, seguita dalle varianti D e B; non è pertanto raro che in soggetti bevitori cronici aventi la variante B siano riportati valori di CDT falsamente negativi.
Falsi positivi, viceversa, si osservano in pazienti con grave insufficienza epatica (cirrosi epatica o cirrosi biliare primitiva).
Inoltre, anche altre condizioni (es. disordini ereditari del metabolismo glicoproteico e trapianti combinati di rene/pancreas) possono causare un aumento di CDT indipendente dal consumo di alcol: sono infatti riportati casi di soggetti normali bevitori, o addirittura astemi, i quali presentano valori di CDT falsamente positivi.
Pertanto, in caso di soggetti positivi o di risultati dubbi è raccomandato eseguire il test della CDT con metodi diversi.
Il Laboratorio
La misura della CDT nel siero viene utilizzata per identificare un cronico eccesso di consumo di alcol e per monitorare l’astinenza durante il trattamento.
Il test CDT è pertanto un marcatore di abuso alcolico di lungo periodo, da non confondere con il test alcolemico, eseguito dalle forze di Pubblica sicurezza con il test del palloncino, il quale rivela una momentanea percentuale di alcol.
Con esclusione della tecnica in IEF (Isoelettrofocusing), primo metodo impiegato per il dosaggio della CDT ma con limiti di inaccuratezza nella determinazione quantitativa e considerato clinicamente utile solo per lo studio delle varianti della Transferrina, i test CDT attualmente utilizzati sono basati su metodo Immunometrico, Capillare e HPLC, il quale rimane il metodo di riferimento.
Recentemente è stato introdotto un metodo Immunometrico nefelometrico molto pratico, ma con sovrastima del 25% rispetto ai valori di CDT dosati con HPLC e scarsamente supportato da studi: pertanto i laboratori tendono ad orientarsi principalmente sull’utilizzo dei test Capillare ed HPLC.
Il test Capillare è utilizzato come metodo di scelta nello screening di primo livello della CDT, in quanto specifico, sensibile, riproducibile, veloce ed automatizzato. Poiché la lunghezza d’onda utilizzata su Capillare (210 nm) non è tuttavia la più specifica per la Transferrina (405-460 nm), è consuetudine utilizzare un secondo metodo di conferma indipendente dal metodo di screening. Il test di conferma, generalmente Cromatografia liquida o HPLC, deve utilizzare un differente principio di separazione e/o di rilevamento, per escludere interferenze analitiche da farmaci o altre componenti e ridurre il numero di falsi positivi. Inoltre, è consuetudine non assegnare il valore di CDT in caso di varianti genetiche.
Linee Guida e Standardizzazione
L’ampia varietà di procedure di misura della CDT ha causato una scarsa uniformità dei risultati e dei limiti di riferimento, ostacolando il confronto dei risultati.
Nel 2005, l’International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC) ha fondato uno specifico gruppo di lavoro: “Standardisation of Carbohydrate-Deficient Transferrin” (IFCC WG-CDT), avente come obbiettivo la standardizzazione della misura della CDT, previa definizione del misurando e determinazione di una procedura di misura, candidata quale riferimento (cRMP).
Il gruppo di lavoro IFCC WG-CDT ha indicato l’isoforma disialo– come principale molecola target per la misura di CDT, poiché essa mostra l’aumento più sensibile e precoce, mentre la misura individuale della sola isoforma asialo-, benché sia identificata solo nei forti bevitori, ha una bassa sensibilità diagnostica, in quanto inizia ad essere rilevabile sempre e solo in presenza di un livello già molto elevato (con aumento di 2-3 volte) della forma disialo-.
Per aumentare la specificità (ad es. nella tossicologia forense) è stata proposta la misura della forma asialo– in aggiunta alla forma disialo-: tuttavia, qualora sia preferito privilegiare la specificità rispetto alla sensibilità, il IFCC WG-CDT ha suggerito di aumentare il cutoff per la forma disialo– anziché aggiungere la misura della isoforma asialo-.
La selezione del cutoff
Il test CDT trova principale impiego quale marcatore di abuso alcolico, nelle indagini di idoneità al lavoro e per il conseguimento/rinnovo della patente di guida.
Non esistono intervalli di riferimento standardizzati del test CDT: pertanto hanno validità quelli che il singolo laboratorio esprime in base al valore medio del test stesso nella popolazione di riferimento.
I valori di CDT possono essere espressi come concentrazione assoluta o come rapporto % rispetto alla Transferrina totale ed i valori di riferimento dipendono dal metodo utilizzato.
Esiste di conseguenza una problematica legata ai valori soglia, o cutoff, ovvero alla distinzione tra un normale soggetto bevitore rispetto ad un bevitore cronico. La problematica investe il sesso, l’età e la capacità di assorbimento di alcol del singolo individuo. Non è facile stabilire un ambito condiviso di intervalli di riferimento, in quanto i vari metodi del commercio hanno differenti cutoff.
Orientativamente, il cutoff di un metodo HPLC è di circa 2,0%, considerando i valori superiori appartenenti ad un alcolista cronico. Con il test Capillare i valori sono più bassi, con una zona grigia intorno a 1,3-1,7%. Viceversa, con metodi Immunometrici sono riportati come normali anche valori di 2,5%.
Pertanto l’applicazione dei criteri di assegnazione degli intervalli di riferimento deve essere rigorosa ma nello stesso tempo utile a capire se il soggetto con elevati valori di CDT è da considerarsi realmente un bevitore cronico.
La routine
Il gruppo di lavoro IFCC WG-CDT ha raccomandato il metodo HPLC come principo analitico di riferimento, mediante determinazione di una ben definita procedura HPLC a scambio anionico.
Il test HPLC è quindi il metodo gold standard, ma è anche un test che necessita di molto tempo (circa 3 test per ora), per cui il l’utilizzatore del test HPLC processa i campioni sulla strumentazione di notte ed anche di giorno.
I test mono-Capillare, oltre ad essere di lenta esecuzione, sono anche interferiti da farmaci, bilirubina, trigliceridi e non identificano sempre le varianti genetiche.
Questo problema esiste anche nei test Capillari a 8 canali, i quali hanno tuttavia il significativo vantaggio di consentire in poche ore l’esecuzione di routine “importanti” (30-50 test al giorno).
In caso di positività di questi test, l’indicazione è sempre di eseguire un test di conferma con un diverso metodo (es. HPLC).
Il sistema Capillare V8 di HELENA
Da alcuni anni è disponibile il test V8 New CDT (cod. 803110): questo test Capillare, associato agli ultimi aggiornamenti di software Platinum, ha consentito di ottenere dei risultati riproducibili e comparabili all’HPLC.
Inoltre, la proposta commerciale di Helena per il test CDT è sicuramente in grado di soddisfare anche l’utilizzatore più esigente.
Infatti, sarà presto disponibile un nuovo e più moderno strumento: il V8 Nexus, primo Sistema Capillare dotato di esclusive innovazioni tecnologiche:
- lettura a 2 lunghezze d’onda, per dosare le proteine con maggiore sicurezza
- elaborazione dei dati con un software sofisticato
- interpretazione dei risultati tramite Sistema esperto
Link all’articolo:
Standardisation and use of the alcohol biomarker carbohydrate-deficient transferrin (CDT). Clin Chim Acta. 2016 May 21;459:19-24. Helander A, Wielders J, Anton R, Arndt T, Bianchi V, Deenmamode J, Jeppsson JO, Whitfield JB, Weykamp C, Schellenberg F; International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine Working Group on Standardisation of Carbohydrate-Deficient Transferrin (IFCC WG-CDT).
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009898116302200
Link all’articolo:
Transferrina carboidrato-carente (CDT): strategie analitiche ed interpretative. Documento di consenso delle Società Scientifiche SIBioC e Gruppo Tossicologi Forensi Italiani afferente alla Società Italiana di Medicina Legale e delle Assicurazioni (GTFI-SIMLA). Gruppo di lavoro SIBioC: Vincenza Bianchi, Roberta Pacifici, Ilaria Palmi, Simona Pichini, Arialdo Vernocchi, Gianpaolo Merlini, Ferruccio Ceriotti, Mario Plebani. Gruppo di lavoro GFTI-SIMLA: Franco Tagliaro, Marzia Bernini, Federica Bortolotti, Marina Caligara, Paola Cassandro, Nadia De Giovanni, Rossella Snenghi, Elisabetta Bertol. Biochimica Clinica, 2010, vol. 34, n. 2. Pp. 128-138.
http://www.sibioc.it/bc/download/articolo/570.
Link alla descrizione del Sistema V8 Helena:
http://www.medicalsystems.it/sistemi/v-8/
Link alla recensione di articolo sulla determinazione di proteine in Elettroforesi Capillare con lettura a 2 lunghezze d’onda, caratteristica compresa tra le implementazioni del nuovo strumento V8 Nexus Helena:
DUAL-WAVELENGTH RECORDING, A SIMPLE ALGORITHM TO ELIMINATE INTERFERENCES DUE TO UV-ABSORBING SUBSTANCES IN CAPILLARY ELECTROPHORESIS
Link alla monografia:
Le patologie alcol correlate. Gianni Testino, Antonietta Florio, Patrizia Balbinot. Caleidoscopio N° 233, Luglio 2015
http://www.medicalsystems.it/wp-content/uploads/2015/10/233-Alcol_Web.pdf
Link alla monografia:
Aspetti biochimici e legali nell’abuso alcolico. Gaetano Magrì. Caleidoscopio N° 165, Aprile 2003
http://www.medicalsystems.it/wp-content/uploads/2003/04/165_Alcol.pdf
Link alla monografia:
Alcol e problemi correlati. Angela Ruggenini, Moiraghi, Vincenzo, Gerbi, Mauro Ceccanti, Paolo Barcucci. Caleidoscopio N° 114, Settembre 1997
http://www.medicalsystems.it/wp-content/uploads/2015/11/114_Alcol.pdf
La rete commerciale di Medical Systems S.p.A. è a disposizione per ulteriori informazioni