La citometria a flusso è una tecnica di misura automatica di popolazioni cellulari, nata con lo sviluppo delle misure quantitative su cellule circa 5 decenni fa ed ormai giunta a una fase di maturità.
Elemento base di questa tecnica è uno strumento di misura che nella sua configurazione tipica prevede una sorgente di luce di eccitazione laser, un sistema idrodinamico di trasporto delle cellule, un sistema optoelettronico di misura della luce diffusa e di fluorescenza e un sistema di memorizzazione e analisi dei dati.
La citometria a flusso è stata progressivamente utilizzata da parte dei laboratori clinici e di analisi. La transazione dalla ricerca alla clinica, di grande importanza pratica, è stata ulteriormente favorita dallo sviluppo di strumentazioni sempre più orientate verso un impiego clinico analitico. Gli strumenti progettati per questi impieghi, anche se un poco meno completi ed elaborati degli apparecchi espressamente destinati alla ricerca, sono oggi assai avanzati nella concezione , semplificati ed affidabili nell’uso.
La disponibilità di strumenti utili ad uso clinico è andata di pari passo allo sviluppo di tecnologie di colorazione delle popolazioni cellulari e di impiego di reattivi marcati, quali anticorpi monoclonali. Le tecniche citometriche sono affidabili in quanto sono affidabili le reazioni che portano la cellula ad emettere un segnale fluorescente proporzionale alla grandezza da misurare, in seguito ad eccitazione con opportuna lunghezza d’onda.
Lo spettro delle grandezze o caratteristiche cellulari che oggi è possibile misurare mediante citometria a flusso è assai ampio e va dalla determinazione dei parametri quali volume, la massa di sostanze (DNA, RNA, proteine, per citare le principali), alla funzione (espressione di antigeni di membrana ed endoplasmatici, determinazione della concentrazione degli ioni calcio, misura del pH, ecc.).
Per alcune di queste misure il grado di riproducibilità e il patrimonio di conoscenze raggiunto è stato tale da suggerirne un impiego di carattere più propriamente applicativo. Infatti le misure citometriche rappresentano oggi in diversi settori clinici un importante elemento di giudizio nella formulazione della prognosi o diagnosi di numerose patologie. Le misure citometriche di interesse clinico condividono con la più generale tecnica citometrica vantaggi e limitazioni. I vantaggi principali consistono nella possibilità di quantizzazione, rapidità ed affidabilità statistica della misura, nonché nella possibilità di standardizzazione dei protocolli e delle misure; l’ ostacolo maggiore, ormai ampiamente superato dalla moderna tecnologia, è stato l’iniziale esigenza di disporre di sospensioni monocellulari, mentre un limite intrinseco è ancora rappresentato dalla globalità della misura, cioè dalla impossibilità di ottenere informazioni sulla distribuzione all’interno della cellula, delle grandezze misurate.
Le due grandi aree in cui le applicazioni cliniche della citometria a flusso hanno trovato il loro maggiore sviluppo sono state quelle della immunofluorescenza e dell’analisi degli acidi nucleici nelle neoplasie. Lo sviluppo degli anticorpi monoclonali ha consentito l’identificazione di gruppi di linfociti con caratteristiche funzionali diverse. La classificazione dei linfociti si è basata sulla cosiddette designazioni di raggruppamento (cluster designation, CD), per ciascuna delle quali esistono uno o più anticorpi. Una applicazione tipica è stata quella dello studio delle sindromi da immunodeficienza acquisita. La tipizzazione linfocitaria è stata ed oggi utilizzata anche in altre patologie, quali le malattie autoimmuni, gli stati di immunodeficienza congenita , le malattie ematologiche non tumorali, i trapianti di rene e di midollo. In questi casi la tecnica citometrica è stata quella più largamente impiegata , tanto che si sono sviluppate sia negli Stati Uniti che in Europa iniziative destinate alla standardizzazione dei metodi ed al controllo della qualità in modo da garantire la massima affidabilità dei risultati.
Un altro settore in cui la citometria a flusso ha rivestito un ruolo importante è quello della diagnosi , classificazione e prognosi dei tumori ematologici, utilizzando anche in questo caso anticorpi utilizzati nello studio di differenziazione dei linfociti normali. Ormai è possibile definire il grado di differenziazione delle leucemie linfoidi acute T e B, parametro di rilevante importanza prognostica. Ulteriori applicazioni sono state trovate nella discriminazione delle leucemie linfoidi e non linfoidi.
La disponibilità di diversi fluoro cromi specifici per gli acidi nucleici, con eccellenti caratteristiche di efficienza quantica, di stabilità nel tempo e di riproducibilità ha permesso di raccogliere una imponente messe di risultati di misure del contenuto di DNA e RNA nei tumori ematologici e solidi. La misura del contenuto di DNA fornisce una duplice informazione: una di carattere citogenetico e l’altra di carattere cinetico. Infatti una parte dei tumori ematologici , e una frazione assai elevata di quelli solidi, sono caratterizzati da contenuto di DNA alterato rispetto a quello normale.
Altro parametro derivabile dalla misura del DNA è la frazione di cellule in sintesi , che fornisce una indicazione dell’attività proliferativa del tumore. Ancora, ulteriori applicazioni di interesse clinico sono stati l’analisi degli spermatozoi e dei cromosomi. Questo campo di applicazione ha consentito la risoluzione del cariogramma umano. L’impiego delle tecniche di bandeggio per lo studio dei cromosomi metafisici ha consentito di correlare specifiche aberrazioni cromosomiche con malattie genetiche e neoplasie, per cui l’analisi citogenetica del cariotipo umano ha assunto un elevato valore diagnostico.
Link alla monografia:
Citometria a flusso : aspetti generali con riferimento particolare allo studio di alcune malattie ematologiche Caleidoscopio N° 113, Giugno 1197
http://www.medicalsystems.it/wp-content/uploads/2015/11/113_Citofluorimetria.pdf
Link alla monografia:
Diagnostica ematologica di laboratorio Morfologia, Tecnologia e Workflow Caleidoscopio N° 239, Dicembre 2018
Analizzatori emocromocitometrici e citometria a flusso: presente e futuro
Gli analizzatori moderni forniscono buone informazioni quantitative, ma non qualitative. Sono validi per il conteggio delle particelle che possono essere attribuiti a una determinata categoria: globuli rossi, piastrine, globuli bianchi. Tuttavia, sono meno affidabili nelle valutazioni di qualità. Ad esempio, l’analizzatore può determinare che si tratta di un granulocita, ma non sarà così preciso nel determinare lo stadio della sua maturazione. La moderne generazioni di strumenti di laboratorio dovrebbero valutare meglio questo indicatore.
Oggi tutti i produttori hanno migliorato la tecnologia associata al principio dell’impedenza di Coulter e hanno configurato il loro software in modo tale da poter estrarre quanti più dati possibile. In futuro, verranno introdotte nuove tecnologie utilizzando la funzionalità della cellula, oltre alla sintesi proteica della sua superficie, che ne indica la funzione e lo stadio di sviluppo.
Un segno di possibile integrazione tra analizzatori emocromocitometrici e citofluorimetri risiede nel fatto che sono stati considerati test standard che passavano alla citometria a flusso, tornando all’ematologia. Ad esempio, non sarebbe sorprendente se gli analizzatori fossero in grado di eseguire il calcolo dei globuli rossi del feto, sostituendo la tecnica di prova manuale Kleinhauer – Bettke. Il test può essere fatto mediante citometria a flusso, ma il suo ritorno al laboratorio di ematologia gli darà un’ampia accettazione. Probabilmente, alla fine, questa terribile analisi in termini di accuratezza sarà più in linea con quanto ci si dovrebbe aspettare dalla diagnostica del 21 ° secolo.
Secondo gli esperti, alcuni semplici test citometrici possono essere adattati per un analizzatore ematologico. Un ovvio esempio è l’identificazione di sottoinsiemi regolari di linfociti T, leucemia cronica o acuta diretta, in cui tutte le cellule sono omogenee con un profilo fenotipico molto chiaro. Negli analizzatori del sangue, le caratteristiche di dispersione possono essere determinate con precisione. I casi di popolazioni miste o numericamente piccole con profili fenotipici insoliti o più aberranti possono essere di più complessa identificazione.
Link alle brochure:
Nuovi analizzatori Mindray BC Serie 6: BC-6200 e BC-6800 PLUS
Un piccolo cubo, una grande differenza
http://www.medicalsystems.it/wp-content/uploads/2015/08/MP012-13-REV1-BC-6800.pdf