I reticolociti sono elementi di transizione tra eritroblasti nucleati e globuli rossi, presenti sia nel midollo osseo che nel sangue periferico. Il conteggio reticolocitario, in termini sia percentuali che assoluti per unità di volume, è l’indicatore principale della entità di produzione dei globuli rossi. Fornisce quindi una rappresentazione attuale dell’attività midollare di eritropoietina e, se l’emoglobina è ridotta, esprime l’efficacia di risposta del sistema eritroide all’anemia. La permanenza in circolo dei reticolociti, in condizioni stazionarie, è di 24 ore.
I reticolociti si definiscono per la presenza di materiale citoplasmatico, costituito prevalentemente da acido ribonucleico ribosomiale, precipitato e colorato in forma di granuli e filamenti dai coloranti sopravitali, come il nuovo blu di metilene e il blu brillante di cresile.
I metodi automatizzati per il conteggio dei reticolociti utilizzano colorazioni sopravitali o fluorocromi e consentono maggiore precisione, accuratezza e riproducibilità rispetto al conteggio dei reticolociti con il microscopio: infatti, mediante analisi automatica di un numero molto maggiore di reticolociti (oltre diecimila), l’errore statistico è minimizzato e viene eliminata la variabilità e soggettività tra osservatori, come pure la variabilità derivante da colorazione, diluizione ed incubazione. Questo garantisce misurazioni riproducibili anche a valori molto bassi e valutazioni diagnostiche anche in caso di reticolocitopenia.
Nei pazienti con emoglobina diminuita la conta reticolocitaria permette la suddivisione iniziale delle anemie, soprattutto quelle normocitiche, in forme senza reticolocitosi, causate o associate a ridotta produzione di globuli rossi (per lesioni centrali di vario tipo dei progenitori midollari) e forme con reticolocitosi causate da (o associate a) aumentata distruzione (emolisi) o perdita (emorragia), con progenitori integri ed efficienti, ma insufficienti per riequilibrare il danno periferico.
L’intervallo di riferimento classico dei reticolociti, senza distinzione per sesso e per età, è di 1±0,5% in valore percentuale e di 50±30×109/L in valore assoluto.
Significato ed intervalli di riferimento delle frazioni reticolocitarie
LFR (Low Fluorescence Ratio) rappresenta la frazione di reticolociti maturi, con valori normali: 78%-92%;
MFR (Medium Fluorescence Ratio) rappresenta la frazione di reticolociti con caratteristiche maturative intermedie, con valori normali: 6%-18%;
HFR (High Fluorescence Ratio) rappresenta la frazione di reticolociti immaturi, con valori normali: 0%-4%;
IRF (Immature Reticulocite Fraction): rappresentata da MFR+HFR, con valori normali 6%-22%.
Frazione immatura dei reticolociti (IRF)
Il parametro IRF determina una percentuale di reticolociti (variabile da 0,0 a 1,0) indotta da una aumentata stimolazione eritropoietinica e conseguente accelerazione in atto della maturazione dei globuli rossi, con immissione in circolo anticipata.
L’IRF indica pertanto la frazione di reticolociti che riflette l’attività eritropoietica midollare “precoce” e corrisponde ai reticolociti più giovani, ad elevato contenuto in RNA.
A seconda degli analizzatori utilizzati questo parametro può avere intervalli di riferimento molto diversi; tuttavia, indipendentemente dall’analizzatore metodo utilizzato, l’IRF è risultato un indice precoce e sensibile di attività eritropoietica.
Utilità clinica della frazione immatura dei reticolociti (IRF)
Molti autori hanno evidenziato l’utilità clinica di refertare il parametro IRF nella diagnosi e monitoraggio delle anemie. Una delle principali applicazioni cliniche dell’IRF è rappresentata dalla valutazione della ripresa della attività midollare dopo trapianto del midollo osseo e in risposta a trattamenti con rh-EPO in dializzati, AIDS, mielodisplasie, monitoraggio trasfusionale nelle anemie neonatali, efficacia di risposta a terapia con vitamina B12, folati, ferro, crisi aplastiche in anemie emolitiche, monitoraggio di trapianto renale.
Il miglior uso clinico di questo parametro, in particolare nella classificazione delle anemie basate sulla valutazione della risposta eritropoietica midollare, si ottiene riportando l’IRF rispetto al conteggio assoluto dei reticolociti.
Un recente studio ha dimostrato che l’IRF, in combinazione con il conteggio dei reticolociti, può essere utile nella diagnosi di Sferocitosi ereditaria, condizione caratterizzata da un elevato numero di reticolociti senza un altrettanto elevato IRF.
Nello studio, il confronto dei parametri per la diagnosi di Sferocitosi ereditaria ha confermato i seguenti dati di efficienza, rispettivamente, per rapporto Ret/IRF (Cutoff: 9,7) e % degli eritrociti ipocromici (Cutoff: 0,5): Sensibilità (%) = 96,7 vs 55,2; Specificità (%) = 89,6 vs 82,1; Valore Predittivo Positivo (%) = 15,9 vs 6,0; Valore Predittivo Negativo (%) = 99,9 vs 98,9.
I laboratori dovrebbero valutare la possibilità di fornire un’interpretazione delle analisi dei reticolociti: se il conteggio di reticolociti assoluto e IRF sono aumentati simultaneamente, potrebbe essere aggiunto un commento interpretativo per sottolineare l’incremento dell’attività eritropoietica ed aiutare i medici a valutare i casi di sospetta anemia emolitica, o nel monitoraggio del trattamento di anemia.
Contenuto di emoglobina dei reticolociti
Altre informazioni clinicamente utili, fornite dagli analizzatori ematologici di ultima generazione, sono indicate da nuovi parametri reticolocitari per la determinazione del contenuto di emoglobina dei reticolociti, dal nome diverso a seconda degli analizzatori ematologici utilizzati ma tra loro equivalenti: contenuto emoglobinico reticolocitario (CHr); equivalente emoglobinico reticolocitario (RET-He); espressione dell’emoglobina reticolocitaria (RHE).
Inoltre, il Volume reticolocitario medio (MCVr o MRV, a seconda dell’analizzatore) ha un’utilità clinica complementare al Contenuto di emoglobina dei reticolociti; questi parametri possono essere utilizzati nella valutazione precoce degli stati di carenza funzionale di ferro, nel monitoraggio terapeutico dei pazienti in terapia marziale o con vitamina B12, in dialisi, nell’anti-doping e per verificare l’efficacia del trattamento.
Utilità clinica del Contenuto di emoglobina dei reticolociti
Il Contenuto di emoglobina dei reticolociti (parametro equivalente: RHE) riflette direttamente la sintesi di emoglobina nei precursori midollari e fornisce una misura della disponibilità di ferro: di conseguenza è un parametro importante, in quanto la sua diminuzione indica un’eritropoiesi ferrocarente anche in situazioni in cui i tradizionali marcatori biochimici (Ferritina e percentuale di saturazione della Transferrina) risultano inadeguati, come negli stati infiammatori o nell’anemia da malattie croniche.
Questo parametro è anche utile per controllare precocemente la risposta alla terapia con ferro per via venosa perché, a differenza del contenuto emoglobinico dei globuli rossi (MCH), il quale evidenzia l’eritropoiesi midollare a lungo termine (2-4 settimane), il Contenuto di emoglobina dei reticolociti (parametro equivalente: RHE) consente di valutare la qualità dell’eritropoiesi midollare in tempo reale, aumentando già dopo 1-3 giorni dall’inizio della terapia.
Le Linee Guida SNLG per l’identificazione, prevenzione e gestione della malattia renale cronica nell’adulto, pubblicate dal Sistema Nazionale per le Linee Guida con il supporto della Società Italiana di Nefrologia (2015), concludono che, nel trattamento dell’anemia in pazienti con malattia renale cronica, i principali parametri a cui far riferimento per la valutazione dell’assetto marziale rimangono i test per saturazione della Transferrina e Ferritina.
Tuttavia, la letteratura ha ampiamente dimostrato l’utilità clinica, nella diagnosi e monitoraggio di anemia, del Contenuto di emoglobina dei reticolociti (parametro equivalente: RHE), riconosciuto come indicatore affidabile della valutazione marziale del midollo emopoietico e parametro efficace e precoce per l’accertamento di condizioni come il deficit funzionale di ferro.
Pertanto numerose Linee Guida nazionali ed internazionali raccomandano di refertare anche il Contenuto di emoglobina dei reticolociti (parametro equivalente: RHE):
-Le Linee Guida per il trattamento dell’anemia nell’insufficienza renale cronica, pubblicate dalla Società Italiana di Nefrologia (2003), raccomandano che lo stato del ferro deve essere valutato con la Ferritina nel siero e con gli indici della disponibilità marziale a livello del midollo, come il Contenuto di emoglobina dei reticolociti (parametro equivalente: RHE) (o, in alternativa: saturazione della Transferrina o % degli eritrociti ipocromici), utili indicatori dello stato di carenza marziale, per la corretta identificazione dei pazienti in grado di aumentare la loro emoglobina in risposta ad un ciclo di terapia marziale.
-Le Linee Guida EBPG per la gestione dell’anemia nei pazienti con insufficienza renale cronica, pubblicate dall’European Renal Best Practice, comitato ufficiale dell’European Renal Association-European Dialysis and Transplantation Association (2004), raccomandano la misurazione in laboratorio del Contenuto di emoglobina dei reticolociti (parametro equivalente: RHE) (o, in alternativa: saturazione della Transferrina o % degli eritrociti ipocromici) per la valutazione del Ferro funzionale disponibile per l’eritropoiesi.
-Le Linee Guida KDOQI di pratica clinica per l’anemia nella malattia renale cronica, pubblicate dalla National Kidney Foundation (2006), raccomandano di dosare il Contenuto di emoglobina dei reticolociti (parametro equivalente: RHE) (o, in alternativa: % degli eritrociti ipocromici, benché questo test non sia adatto per l’uso di routine in molti contesti, perché il tempo di conservazione e trasporto del campione innalza falsamente i risultati) insieme a Emoglobina, Ferritina e saturazione della Transferrina, come test appropriato per valutare l’adeguatezza di ferro per l’eritropoiesi, in quanto la combinazione di questi test fornisce importanti informazioni sul bilancio esterno del ferro e sulla distribuzione interna del ferro.
-Le Linee Guida KDIGO di pratica clinica per l’anemia nella malattia renale cronica, pubblicate dalla National Kidney Foundation con una cooperazione internazionale (2012), indicano che il Contenuto di emoglobina dei reticolociti (parametro equivalente: RHE) (o, in alternativa: % degli eritrociti ipocromici), può essere usato, in aggiunta o al posto dei test Ferritina e saturazione della Transferrina, per la valutazione dello stato del ferro nell’indagine di anemia.
-Le Linee Guida per la diagnosi di laboratorio di carenza funzionale di ferro, pubblicate dalla British Society for Haematology (2013), raccomandano il test per il Contenuto di emoglobina dei reticolociti (parametro equivalente: RHE) (o, in alternativa: % degli eritrociti ipocromici, benché disponibile su pochi analizzatori a differenza del Contenuto di emoglobina dei reticolociti, disponibile su numerosi analizzatori) come opzione consolidata con elevato livello di evidenza per l’identificazione di carenza di ferro funzionale. Inoltre, il grande aumento di precisione della conta automatizzata dei reticolociti e la disponibilità di misura della frazione immatura dei reticolociti (IRF) e degli indici specifici di Contenuto di emoglobina dei reticolociti (parametro equivalente: RHE) e di Volume reticolocitario medio (parametro equivalente: MRV) offrono la possibilità di valutare il cambiamento di stato del ferro nella gestione dei pazienti con insufficienza renale cronica in terapia con agenti stimolanti l’eritropoiesi.
-Le Linee Guida ECCO sulla diagnosi e la gestione di carenza di ferro e anemia in malattie infiammatorie croniche intestinali, pubblicate dall’European Crohn’s and Colitis Organisation (2015), raccomandano che un iter diagnostico esteso per l’anemia comprenda anche il Contenuto di emoglobina dei reticolociti (parametro equivalente: RHE) (o, in alternativa: % degli eritrociti ipocromici), come utile marcatore di carenza funzionale di ferro per la diagnosi di eritropoiesi ferro carente.
-Le Linee Guida NICE per la gestione dell’anemia nella malattia renale cronica, pubblicate dall’UK National Clinical Guideline Centre (2015), raccomandano come test diagnostico prioritario nella valutazione e accertamento di anemia il Contenuto di emoglobina dei reticolociti (parametro equivalente: RHE) (o, in alternativa: % degli eritrociti ipocromici, ma solo se la valutazione del campione di sangue è possibile entro 6 ore), per determinare lo stato del ferro e diagnosticarne la carenza e per valutare il potenziale di risposta alla terapia e l’ottimizzazione dell’eritropoiesi nel monitoraggio dello stato del ferro durante il trattamento.
L’ANALIZZATORE MINDRAY BC-6800 E LA DETERMINAZIONE DEI PARAMETRI RETICOLOCITARI
L’analisi dei reticolociti viene eseguita in completa automazione random, da provetta primaria, durante lo stesso ciclo analitico dell’esame emocromocitometrico, utilizzando un reagente specifico contenente un colorante fluorescente per acido nucleico.
Nella esclusiva tecnologia SF cube di MINDRAY i reticolociti sono differenziati rispetto agli altri globuli rossi maturi attraverso la loro colorazione fluorescente, dopo sfericizzazione isovolumetrica.
Con la tecnologia SF cube i reticolociti sono differenziati dalle altre cellule mediante la reazione con colorante fluorescente e la luce laser.
Il diluente specifico agisce sulle cellule sfericizzandole ed il colorante, costituito da una cianina asimmetrica, penetra attraverso la membrana cellulare e si lega agli acidi nucleici colorando l’RNA dei reticolociti e l’RNA/DNA delle cellule nucleate.
La popolazione dei reticolociti è separata dai globuli rossi maturi in funzione del contenuto in RNA e dalle altre cellule nucleate in relazione al contenuto di RNA/DNA.
Nel citogramma RET le cellule vengono posizionate in base al loro volume attraverso il side scatter lungo l’asse delle Y e in base all’intensità del segnale fluorescente lungo l’asse X.
La popolazione dei reticolociti è suddivisa in tre frazioni (HFR-MFR e LFR) in funzione del loro contenuto di RNA.
Estendendo questo asse è possibile identificare in questo canale anche la popolazione leucocitaria in funzione del volume e della intensità di colorazione fluorescente del nucleo.
Oltre ai parametri tradizionali di numero assoluto di reticolociti (RET#) e % di reticolociti (RET %), il BC-6800 fornisce anche dati addizionali come la frazione di reticolociti immaturi (IRF).
Inoltre, il BC-6800 fornisce anche il parametro MRV, il quale esprime il volume reticolocitario medio ed il parametro RHE (Espressione emoglobinica dei reticolociti), il quale indica il Contenuto di emoglobina dei reticolociti ed è un test equivalente ai parametri CHr e RET-He.
Valori di riferimento per l’analizzatore MINDRAY BC-6800:
Media 2,5% 97,5%
Reticolociti 109/L 44,99 23,18 85,18
parametro refertabile, marcato CE
IRF (Frazione immatura dei reticolociti) 0,053 0,015 0,14
parametro refertabile, marcato CE
RHE (Contenuto reticolocitario di emoglobina) pg 32,79 29,41 35,70
parametro refertabile, marcato CE,
equivalente ai parametri CHr e RET-He
MRV (Volume reticolocitario medio) fl 108,87 97,79 117,98
parametro refertabile, marcato CE,
equivalente al parametro MCVr